GIRIS

Prostat kanseri erkeklerde görülen en yaygin kanserlerden bir tanesidir. Ancak gelisiminde görev alan moleküler mekanizmalar hakkinda çok az sey bilinmektedir[1]. Prostat, seksüel davranisla beraberlik gösteren insan papillomavirüs (human papillomavirus; HPV) enfeksiyonlarinin bir hedefi konumundadir. HPV servikal kanserlerin en büyük nedenidir[2]. Belirli yüksek riskli HPV tiplerinin servikal karsinogenezde rol oynadigi belirlenmistir. Servikal kanserlerle prostat kanseri karsilastirildiginda kansere neden olan faktörler ve klinik gidisat açisindan bu iki kanser tipi bazi ortak özelliklere sahiptir[3]. Birkaç çalismada prostat kanseri ve benign prostat hiperplazileri (BPH)'nde HPV DNA varligi gösterilmesine karsin diger bazi çalismalarda HPV varligi gösterilmemistir[4,5]. Prostat kanseri ile HPV arasindaki iliskilerin arastirildigi çalismalarda HPV DNA pozitifligi açisindan farkliliklar saptanmistir. Bu farkli bulgular HPV DNA tespitinde kullanilan çesitli yöntemlerin farkli duyarliliklara sahip olmasi, prostatik örneklerdeki HPV’nin düsük kopya sayisi ve prostat tümörlerindeki histolojik ve genetik heterojeniteyle açiklanabilir. Sonuç olarak serolojik epidemiyoloji, prostat kanser prevalansi ve HPV-16 ya da HPV-18 antikor düzeyleri arasinda baglanti gösterememistir[3].Bundan dolayi prostat karsinogenezinde HPV’nin muhtemel rolü hala açik degildir. Interlökin (IL)-10, T-helper tip 2 sitokin olup, IL-6 gibi proinflamatuvar sitokinlerin üretimini ve hümoral yaniti baskilamakta ve enfeksiyon hastaliklarinin gelisiminde önemli bir rol oynamaktadir. IL-10 üretim düzeyleri, inflamatuvar ve hümoral yanit arasindaki dengeyi kontrol ederek immün düzenlemede kritiktir[6,7]. IL-10 üretim kapasitesinin promotor bölge içindeki birkaç polimorfizme bagli olarak degistigi tespit edilmistir[8]. Promotor bölge içerisinde -1082, -819 ve -592 pozisyonlarindaki üç biallelik polimorfizm üç farkli haplotip meydana getirir. Bunlar, GCC, ACC ve ATA’dir[9]. Literatürde IL-10 haplotipleri ve inflamatuvar hastaliklarinin siddeti arasinda iliski gösterilmesine ragmen prostat kanserinde HPV DNA pozitifligi ve IL-10 genotipleri arasinda iliskilerin arastirildigi çalismalar bulunmamaktadir[9,10]. IL-10 geninin promotor bölgesindeki heterojenite HPV enfeksiyonuna ilk yanitin olusmasinda ve kalici HPV enfeksiyonunun gelisiminde bir rol oynayabilir. Bu çalismada, BPH ve prostat kanseri örneklerinde IL-10 -1082 A/G dagilimi ile HPV DNA pozitifligi arasindaki iliskilerin arastirilmasi amaçlanmistir.

MATERYAL ve METOD

Hasta Popülasyonu Prostat doku örnekleri 40 adenokarsinomali ve 68 BPH'li 108 hastadan toplandi. Örnekler 91 (%84.2) hastada transüretral rezeksiyon, 17 (%15.8) hastada radikal prostatektomi kullanilarak toplanmistir. Tüm doku örnekleri histolojik olarak incelendi. Kirk adenokarsinomali olgudan dokuzu skor 10 (%25), sekizi skor 9 (%20), dördü skor 8 (%10), yedisi skor 7 (%17.5), 11'i skor 6 (%27.5) ve biri skor 5 (%12.5) olarak tespit edildi. Hastalarin tamami Elazig ili ve çevresinde yasamaktaydi. Çalisma için Helsinki önerilerine göre yerel etik kuruldan onay alindi. Genotipleme Dokular formalinle fikse edilip parafine gömülmüstü. Parafin bloklardan sonraki analizler için üç parça 5 ± 10 µm’lik kalinlikta kesitler alindi. Bir kesit hematoksilen-eozin ile boyanip histopatolojik olarak degerlendirildi. Parafine gömülü tümör örneklerinden genomik DNA proteinaz K sindirimi, takiben fenol-kloroform ekstraksiyonu ve etanol ile çöktürme islemleriyle elde edildi. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için izole edilen DNA’nin kalitesinin belirlenmesi amaciyla beta-globulin geninin 268 bç uzunlugundaki bir parçasi spesifik primerler kullanilarak çogaltildi[11]. HPV tespiti ve IL-10 -1082 gen polimorfizminin genotiplenmesinde kullanilan primer dizileri Tablo 1’de verilmistir. IL-10 -1082 tek nükleotid polimorfizminin (single nucleotide polymorphism; SNP) tespiti için allel spesifik PCR yöntemi kullanildi[6]. Isi profili; 95°C’de 30 saniyelik denatürasyon, 54°C’de 30 saniyelik baglanma, 72°C’de 30 saniye uzama olacak sekilde 30 siklusa ayarlandi. PCR ürünleri, etidiyum bromid varliginda %2’lik agaroz jelde tespit edildi. DNA bantlari ultraviyole isik altinda görüntülendi. DNA örneklerinde HPV dizilerinin tespiti Khaled ve arkadaslarinin yöntemine göre analiz edildi[12]. PCR için reaksiyon sartlari; 94°C’de bes dakika ön denatürasyon, 94°C’de bir dakikalik denatürasyon, 54°C’de iki dakikalik baglanma ve 72°C’de iki dakika uzama asamalarini içerecek sekilde 39 siklusta gerçeklestirildi. Son döngüdeki uzama basamagi 10 dakika yapildi. Amplikonlar ultraviyole isik altinda büyüklüklerine göre tanimlandi. Istatistiksel Analizler Veriler, %95 güven araliginda anlamli olarak kabul edildi. Genotip ve HPV pozitiflik oranlarinin gruplar arasinda karsilastirilmasi için ki-kare ve Fisher-exact testleri kullanildi. HPV pozitifligi ve IL-10 genotipleri arasindaki iliskinin tespiti için Pearson korelasyon ve Spearman Rho testleri yapildi. p degerinin 0.05’ten küçük olmasi anlamli olarak degerlendirildi. Tüm istatistiksel testlerin uygulanmasinda SPSS 12.0 versiyonu kullanildi (SPSS, Chicago IL, USA).

BULGULAR

Prostat doku örneklerinin tümü beta-globin için pozitif olarak bulundu ve PCR yöntemi kullanilarak HPV DNA arastirildi. Ilaveten IL-10 -1082 polimorfizminin allelik frekanslari benign ve malign tümörlü hastalarda basarili bir sekilde tespit edildi. Her iki gruptaki allel frekanslarinin Hardy-Weinberg esitligine uyumlu oldugu bulundu. Prostat kanseri ve BPH doku örneklerinde IL-10 -1082 genotip dagilimlari ki-kare testiyle karsilastirildiginda iki grup arasinda istatistiksel olarak anlamli bir farklilik bulunmadi (p> 0.05). Yüz sekiz örnegin 31 (%28.7)’inde HPV DNA pozitif bulundu. Altmis sekiz BPH örneginin 15 (%22)’inde ve 40 prostat kanseri örneginin 16 (%40)’sinda HPV DNA bulundu (Tablo 2). BPH ve prostat kanseri örnekleri HPV DNA pozitifligi açisindan degerlendirildiginde iki grup arasinda istatistiksel olarak anlamli bir farklilik bulundu (p= 0.047). HPV DNA pozitifligi ve IL-10 -1082 genotipleri tüm prostat doku örneklerinde degerlendirildiginde herhangi bir iliski saptanmadi (p> 0.05). Benzer sekilde HPV DNA pozitifligi ve IL-10 -1082 genotipleri arasinda iliski olup olmadigi prostat kanseri ve BPH örneklerinde ayri ayri degerlendirildiginde de herhangi bir iliski tespit edilmedi (p> 0.05). Tablo 2’de prostat kanseri ve BPH’de HPV DNA pozitiflik oranlari ve IL-10 -1082 genotip dagilimlari gösterilmistir.

TARTISMA

Çalismamizda HPV çalismalariyla paralel olarak prostat kanserli 40 hastadan ve BPH’li 68 hastadan allel spesifik PCR ile IL-10 -1082 A/G polimorfizmi analiz edildi. Mevcut çalisma parafine gömülü prostat dokularinda IL-10 genindeki -1082 A/G polimorfizm genotipleri ve HPV DNA pozitifligi arasindaki iliskilerin arastirildigi ilk çalismadir. Bu çalismanin en önemli bulgusu prostat kanseri ve BPH gruplari arasinda HPV DNA pozitifligi açisindan istatistiksel olarak anlamli bir farklilik bulunmasidir. Son zamanlarda yapilan bazi çalismalarda, çesitli viral enfeksiyonlar ve IL-10 genotipleri arasinda iliski oldugu rapor edilmistir. Bu çalismalarda özellikle IL-10 geninin düsük üretim düzeyi ile beraberlik gösteren haplotiplerle enfeksiyonun siddeti arasinda bazi iliskilerin oldugu tespit edilmistir. Örnegin; IL-10 geninin polimorfizmi bazi yaygin herpes virüslere dirençle iliskilidir. Ilaveten ayni gen, reaktivasyon sürecinde enfeksiyon siddetini düzenlemede görev alir. Pozisyon -1082’deki A allelini tasiyan siddetli Epstein-Barr virüs (EBV) enfeksiyonlu hastalarin sayisinin kontrol popülasyonuna kiyaslandiginda arttigi belirlenmistir[13]. Diger bir çalismada ATA haplotip tasiyicilarinin herpes zosterli (dormant varisella zoster virüs; VZV) hastalarda artmis oldugu gözlenmistir[14]. ATA haplotipinin IL-10’un düsük ürün oraniyla iliskili oldugu bilinmektedir. Bundan dolayi proinflamatuvar sitokinlerin artan düzeylerinin VZV’nin reaktivasyonu ve EBV enfeksiyonunun siddetinden sorumlu olmasi olasidir. Fernandes ve arkadaslari HPV negatif ve HPV pozitif servikal lezyonlarda sitokin gen polimorfizmleri açisindan önemli bir farklilik olmadigini saptamislardir[15]. Biz de çalismamizda benzer sekilde prostat doku örneklerinde HPV DNA pozitifligi ile IL-10 genotipleri arasinda iliski olmadigini tespit ettik. Bu çalismada tespit edilen HPV DNA pozitiflik orani, prostat kanseri ve BPH dokulari için daha önceden rapor edilmis olan %0-61 oraninin içerisindedir. (Tablo 3)[4,16,17,18,19,20,21,22,23]. Son zamanlarda prostat doku örneklerinde yapilan çalismalarin bazilarinda HPV DNA tespit edilirken bazilarinda tespit edilmemistir[24]. Daha önceki analizlerde de ortaya konan bu farkli verilerin nedenleri Cuzick ve Strickler tarafindan tartisilmistir. Prostat doku örnekleri HPV pozitifliginin farkli frekanslari için muhtemel açiklamalar popülasyonel, cografik, çevresel, genetik heterojenite ve metodolojik problemler olabilir[5,25]. HPV DNA’si üretral ve anal dokularda tespit edildiginden farkliliklarin örnek alma prosedürleri boyunca HPV kontaminasyonundan kaynaklanabilecegi de düsünülmektedir[8,16]. Bu kontaminasyondan dolayi bazi yazarlar doku kaynagi olarak radikal prostatektomiyi ya da neoplastik örneklerde mikrodiseksiyonu önermektedirler. Çalismamizda kullanmis oldugumuz prostat kanseri örneklerinin sadece bir kisminda radikal prostatektomi kullanilmistir. Bu açidan sonuçlarimizin diger bazi çalismalardan fakliliklar göstermesinin sebeplerinden biri de örneklerin bir kisminda üretral veya anal dokulardan HPV kontaminasyonlarinin varligi olabilir. Prostatik lezyonlarda HPV enfeksiyonunun etyolojik rolü tartismalidir. Bazi çalismalarda HPV enfeksiyonunun prostatik neoplazide bir etyolojik role sahip oldugu ileri sürülürken, bazi raporlarda HPV’nin bu dokularda bulunma orani çok düsük oldugu için HPV’nin prostatik kanser riskini artirmadigi ve HPV’nin prostat karsinogenezinde nedensel bir role sahip olmadigi öne sürülmüstür[6,17,19,21]. BPH’de HPV’nin etyolojik rolü BPH dokularinda HPV DNA’nin düsük tespit oranlarindan dolayi sorgulanabilir[20]. Chen ve arkadaslari, prostatik hastalik ve HPV DNA varligi veya daha önceden geçirilmis HPV enfeksiyonu arasinda bir iliski gösterememislerdir. Prostatik dokuda HPV DNA bulgusunun genellikle aktif enfeksiyonu göstermeyecegini ya da prostatik hastaligin HPV’den kaynaklanmayabilecegini belirtmislerdir. Bundan dolayi prostatik hastalikli bireylerin geçici enfeksiyona sahip olabilecegini ifade etmislerdir[3]. Çalismamizda analiz edilen örneklerde prostat kanseri (%40) ve BPH (%22) arasinda HPV pozitifligi açisindan anlamli bir farklilik bulunmustur. HPV DNA’nin varligi, HPV pozitifligiyle prostat kanserlerinin en azindan bir kisminin iliskili oldugu varsayimini desteklemektedir. HPV ile enfekte bireylerde virüs genellikle temizlenmektedir. Ancak virüs özellikle devam eden enfeksiyona yol açarsa prostat kanserine neden olabilir. HPV DNA’nin varligi hastalarin en azindan bir kisminda HPV’nin prostati daha önceden infekte ettiginin bir göstergesi olabilir. Bozuk sitokin üretimi HPV’nin patolojik sürecine katki saglamaktadir[7]. Monositler IL-10’un ana kaynagidir ve IL-10 tarafindan aktive edilen hücresel immünite HPV-barindiran hücrelerin eliminasyonunda kritik roller oynamaktadir[7,24,26]. IL-10 promotorundaki genetik heterojenite sitokinin üretiminde degisiklige neden olabilir[8]. Xu ve arkadaslari, IL-10’un farkli üretimine neden olan IL-10 -1082 polimorfizminin prostat kanseri için risk faktörü oldugunu bulmuslardir ve genin etkisini damarlanmada görev alarak yaptigini ileri sürmüslerdir[27]. McCarron ve arkadaslari, IL-10 AA genotipinin prostat kanserli hastalarda saglikli gruplara oranla arttigini rapor etmislerdir[28]. Fakat Michaud ve arkadaslari, IL-10 -1082 genotipi ve prostat kanseri riski arasinda bir iliski bulamamislardir [29]. Bu çalismada prostat kanseri riski ve majör IL-10 haplotipleri arasinda bir iliski gözlemlemedik. Prostat kanseri ve BPH gruplari ki-kare testiyle (p> 0.05) analiz edildiginde IL-10 -1082 için genotip frekanslarinin oranlari arasinda anlamli bir farklilik belirlenmemistir. Çalismamizla diger çalismalar arasindaki farkliliklarin en önemli nedenlerinden birinin polimorfizmlerin özellikle popülasyonlar arasinda degiskenlik göstermesi olabilecegini düsünmekteyiz. Sonuç olarak; bu çalismada HPV DNA pozitifligi açisindan prostat kanseri ve BPH örnekleri arasinda anlamli bir farklilik bulunmustur. HPV DNA pozitifliginin insanda prostat kanseri gelisiminde önemli rol oynayabilecegi düsünülmektedir. Ancak bu çalismanin bazi kisitlayici özellikleri vardir. Çalisilan hasta sayisi azdir. HPV tiplemesi yapilmamistir ve polimorfizm analizleri sadece parafin gömülü dokudan yapilmistir. Bu konunun aydinlatilmasi için daha fazla epidemiyolojik ve moleküler biyoloji arastirmalarina ihtiyaç duyulmaktadir.